Die beiden Brüder Charlie (John C. Reilly) und Eli (Joaquin Phoenix) werden in den 1850er-Jahren «The Sisters Brothers» genannt.

Der Wilde Westen befindet sich 1850 im Goldrausch. Die Brüder Eli (John C. Reilly) und Charlie Sisters (Joaquin Phoenix), denen ihr Ruf als Auftragskiller weit vorauseilt, werden auf Hermann Kermit Warm (Riz Ahmed) angesetzt. Dieser ist auf dem Weg nach Kalifornien. Auf seiner Reise trifft er auf Morris (Jake Gyllenhaal), der ihn fortan begleitet. Doch was für die Brüder als einfacher Auftrag beginnt, entwickelt sich zu einer gefährlichen und blutigen Verfolgungsjagd quer durchs Land. Dabei zeigt sich, wie verschieden die beiden Brüder sind: Charlie ist ein skrupelloser Killer - Eli ein Grübler, der sich mit geradezu existenziellen Fragen beschäftigt. Als die beiden schliesslich in Kalifornien eintreffen, nehmen die Ereignisse eine höchst unerwartete Wendung...